Viral modulation of interferon (IFN) responses to african swine fever virus (ASFV)

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A imunidade inata constitui a primeira resposta dada por um hospedeiro quando atacado por agentes patogénicos. A resposta imune baseia-se em genes codificados na linha germinativa, chamados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Estes conseguem distinguir o “Eu” do “não-Eu”, reconhecendo padrões moleculares conservados ao longo da evolução dos vários agentes patogénicos, chamados padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs). No caso dos vírus, um parasita intracelular obrigatório, os PAMPs mais importantes e mais estudados são o seu material genético, tal como o DNA genómico viral, RNA de cadeia dupla (ds) ou simples (ss) ou a estrutura RNA viral, 5’- trisfosfato-RNA. Existem vários PRRs, que podem ser agrupados em classes: os receptores transmembranares do tipo Toll (TLRs), os receptores citoplasmáticos do tipo RIG-I (RLRs), os receptores do tipo Nod (NLRs) e os receptores do tipo AIM2 (ALRs). Os PRRs iniciam uma sinalização em cascata que culmina com a activação de factores de transcrição, que entre outros, vão induzir a produção e excreção duma citoquina, o interferão (IFN). Este grupo de citoquinas é composto por três classes, IFN tipo I (p.e IFN-α/β) , tipo II (p.e IFN-γ) ou do tipo III (p.e. IFN-λ). O IFN pode despoletar variados efeitos anti-virais. A cascata de sinalização estimulada pelo IFN inicia-se com a ligação do IFN ao seu respectivo receptor extra celular que ,através de fosforilações, permite a activação de receptores intracelulares. Já no interior da célula, sinalizadores de transdução e ativadores da transcrição (STATs) são recrutados e fosforilados, o que permite a formação de homo ou heterodímeros que migram para o núcleo. No núcleo, as STATs ligam-se a zonas promotoras de genes estimulados pelo IFN (ISGs), para promover a transcrição de mais de 300 ISGs com propriedades anti-virais. No caso do estímulo causado por IFN do tipo I, os complexos formados pelas STATs vão ligar-se ao elemento de resposta estimulado pelo IFN (ISRE). No caso do IFNs do tipo II, os complexos ligam-se à sequência activada pelo IFN-λ (GAS). Os ISGs facultam ao hospedeiro diversas estratégias para combater a infeção viral. Apesar de os mamíferos possuírem um sistema imune bastante evoluído, os vírus também têm evoluído estratégias para evitar e/ou manipular as defesas do hospedeiro, dedicando uma parte substancial do seu genoma a estas estratégias. Estas podem ir desde uma interferência global na expressão e/ou síntese de proteínas das células do hospedeiro, ou serem mais específicas, diminuindo o impacto dos IFNs. O estudo destas interações, pode não só ser útil para conhecer os mecanismos de infecção do vírus, mas também para perceber melhor os mecanismos de defesa do hospedeiro. Estes conhecimentos podem permitir o desenvolvimento de terapias e tratamentos anti-virais ou mesmo anticancerígenos. A peste suína africana (ASF) é uma doença que nos porcos domésticos (Sus sacrofa) é tipicamente hemorrágica e leva normalmente à morte do hospedeiro. Contudo, as infecções são assintomáticas nos hospedeiros naturais, o javali, o porco selvagem e a carraça, sendo esta última, um dos principais vectores de transmissão do vírus da peste suína africana (ASFV), tornando o seu controlo difícil sem uma vacina. Nos últimos anos, devido ao grande desenvolvimento urbano e consumo de carne de porco, têm havido surtos de ASF em África, causando perdas devastadoras. O ASFV é um virus de DNA de cadeia dupla, o único arbovírus de DNA e o único membro da familia Asfaviridae, infectando principalmente macrófagos e monócitos. Tal como todos os vírus, o ASFV contém genes que manipulam a biologia da célula do hospedeiro, como por exemplo, genes que inibem a apoptose e respostas imunes controladas pelo factor nuclear kappa B (NFκB), entre outros. Contudo, ainda não foi demonstrado que algum gene do ASFV consiga inibir a resposta do IFN. Isto é surpreendente, pois o ASFV infecta macrófagos, um tipo de célula sensível ao IFN e porque a sua infecção persistente, é incompatível com uma resposta efectiva mediada por IFN. O K205R é um gene do ASFV sem função definida, mas ensaios preliminares de luciferase mostraram que este gene consegue inibir a resposta do IFN. Contudo, os mecanismos utilizados pelo K205R nesta inibição são desconhecidos. O objectivo desta dissertação de mestrado é tentar perceber melhor estes mecanismos e determinar a sequência mínima necessária para que o K205R tenha o efeito observado. O K205R foi isolado através de PCR, utilizando como molde o DNA genómico da estirpe do AFSV, BA71. Subsequentemente, foiclonado no plasmídeo pcDNA3, que contém um marcador molecular, a hemaglutinina (HA), a montante da zona de inserção do gene. Para determinar a extensão da ação do K205R, foram feitos ensaios de luciferase utilizando células transfectadas com repórteres de luciferase sobre o controlo dos promotores de IFN- β, ISRE e GAS. O K205R mostrou inibição para todos os reporteres. Para tentar definir a zona do K205R responsável pelo efeito observado, fez-se uma previsão da estrutura secundária da proteína do K205R, recorrendo à bioinformática, que permitiu identificar uma sequência “coiled-coil” putativa, uma estrutura secundária associada a interações entre proteínas. Também é sugerida uma sequência putativa para um sinal de exportação nuclear (NES). Com base nesta análise foram construídos quatro fragmentos do K205R e posteriormente clonados no pcDNA3. Depois de se verificar a sequencia correcta de DNA de cada um dos clones e expressão das suas proteinas em células vero transfectadas , o passo seguinte foi verificar a localização celular destes fragmentos através de imunofluorescência nestas mesmas células. Esta experiência permitiu verificar que de facto, os fragmentos que não tinham a sequência putativa NES, em comparação com células transfectadas com o K205R inteiro, tinham uma maior acumulação nuclear. Para estudar o mecanismo, e a que nivel o K205R actua para inibir a via de sinalização do ISRE, foi feito um “western blot” utilizando extractos proteicos de células VERO transfectadas com os diferentes fragmentos do K205R e posteriormente estimuladas com IFN-β durante 15 minutos e durante 45 minutos. Esta experiência permitiu verificar que a fosforilação da STAT1 diminui na presença do K205R, contudo, apenas um fragmento reproduziu este efeito. Este fragmento de 75 aminoácidos não contém a sequência, nem para a sequência “coiled-coil”, nem para NES. Esta dissertação de mestrado apresenta resultados consistentes com a existência de um NES funcional na sequência do K205R, uma inibição da fosforilação da STAT1 mediada pelo K205R, mas também apresenta uma abordagem para determinar os mecanismos utilizados pelo K205R para inibir a indução e o impacto do IFN-β. Contudo, mais experiências têm de ser feitas para realmente se comprovar a existência de um NES, como por exemplo, ensaios de imunofluorescência de células transfectadas com K205R na presença de Leptomicina B, um inibidor da exportação nuclear. Também será necessário estudar as vias de sinalização inibidas pelo K205R que não foram abordadas neste trabalho, tal como a via de indução de IFN-β e a via do GAS.A key part of the innate response to virus infections is the interferon (IFN) response. This can limit virus replication and dissemination and is a critical factor in controlling virus infections, particularly persistent viruses. Many viruses encode proteins which interfere with induction of IFN and IFN-activated pathways and these can have important roles in virus pathogenesis and persistence. African Swine Fever (ASF) causes major economic losses in many African countries and is a threat to pig farming worldwide. There is no vaccine and therefore options for disease control are limited. In Europe, there is always the danger of accidental introduction of the virus, as indeed occurred in Portugal in 1957, causing severe financial losses. Thus, defining the mechanism of proteins involved in evasion of the host’s defense response and in virus virulence is of extreme interest, so we can understand the virus and try to develop strategies to reduce ASF impact. ASFV is a large cytoplasmic DNA virus which encodes between 160 to 175 open reading frames. Many of its genes are not essential for replication in vitro, but are host evasion strategies facilitating virus replication and transmission in vivo. These include proteins which inhibit host defence systems. Surprisingly, since ASFV can survive as a persistent virus, no ASFV proteins have been described which inhibit the IFN response. However, the early gene K205R, might have an impact on IFN response. Luciferase assays, shown inhibitions of IFN induction (IFN-β) and IFN-signalling (ISRE, GAS) pathways. Using a bioinformatics tool (Jpred), we got a predication of K205R protein secondary structure. Based on this prediction, deletion mutant fragments of K205R were constructed and used in immunofluorescence and western blot assays. The immunofluorescence results suggest the presence of a functional nuclear export signal (NES) motif in the K205R protein sequence. Western blot experiments suggested that K205R is affecting the phosphorylation status of STAT1, in cells stimulated with IFN-β (ISRE pathway). Although it was not possible to clearly determine the minimum sequence needed for all the functions of K205R, the results suggest that K205R inhibition of the impact of IFN type I, depends on a sequence within amino acids 130 and 205, which affects STAT1 phosphorylation. Further experiments should be done to investigate the mechanism of K205R inhibition in the pathways not covered on this thesis (IFN-β induction pathway and GAS pathway). The existence of functional NES also needs confirmation

Sharp mixed norm spherical restriction

Let $d\geq 2$ be an integer and let $2d/(d-1) < q \leq \infty$. In this paper we investigate the sharp form of the mixed norm Fourier extension inequality \begin{equation*} \big\|\widehat{f\sigma}\big\|_{L^q_{{\rm rad}}L^2_{{\rm ang}}(\mathbb{R}^d)} \leq {\bf C}_{d,q}\, \|f\|_{L^2(\mathbb{S}^{d-1},{\rm d}\sigma)}, \end{equation*} established by L. Vega in 1988. Letting $\mathcal{A}_d \subset (2d/(d-1), \infty]$ be the set of exponents for which the constant functions on $\mathbb{S}^{d-1}$ are the unique extremizers of this inequality, we show that: (i) $\mathcal{A}_d$ contains the even integers and $\infty$; (ii) $\mathcal{A}_d$ is an open set in the extended topology; (iii) $\mathcal{A}_d$ contains a neighborhood of infinity $(q_0(d), \infty]$ with $q_0(d) \leq \left(\tfrac{1}{2} + o(1)\right) d\log d$. In low dimensions we show that $q_0(2) \leq 6.76\,;\,q_0(3) \leq 5.45 \,;\, q_0(4) \leq 5.53 \,;\, q_0(5) \leq 6.07$. In particular, this breaks for the first time the even exponent barrier in sharp Fourier restriction theory. The crux of the matter in our approach is to establish a hierarchy between certain weighted norms of Bessel functions, a nontrivial question of independent interest within the theory of special functions.Comment: 21 page

EDUCATION AS INTERDISCIPLINARY KNOWLEDGE: PRODUCTION, THEORY AND PRACTICE – IN SEARCH OF AN ESSAY

Throughout the text, we will be combining a dialogue of experiential construction and knowledge, linking methodology and object, a method that by its nature should be integrated by mobilising processes and procedures of various genres. We will analyse some aspects of Education as an Interdisciplinary Area and Field of Knowledge in theoretical and theoretical and practical terms. We will highlight the concepts of multidisciplinary, interdisciplinary, and transdisciplinary, having in mind the cross-cutting dynamics of Curriculum and Knowledge. We will mention authors whose quite relevant studies potentiate an integrated curricular perspective that integrates Training, particularly the Multidimensional Training of Teachers. We will mention some legislation passed as part of the Portuguese Educational System, which helps understand the efforts to introduce interdisciplinary practices in the curriculum at the various levels of education in line with European and even global conceptions. We will highlight, among other possibilities, various areas of knowledge and specialties that substantially contribute – or could contribute – towards interdisciplinary reflection and work, particularly Philosophy of Education and Philosophy of Curriculum

EDUCATION AS INTERDISCIPLINARY KNOWLEDGE: PRODUCTION, THEORY AND PRACTICE – IN SEARCH OF AN ESSAY

Throughout the text, we will be combining a dialogue of experiential construction and knowledge, linking methodology and object, a method that by its nature should be integrated by mobilising processes and procedures of various genres. We will analyse some aspects of Education as an Interdisciplinary Area and Field of Knowledge in theoretical and theoretical and practical terms. We will highlight the concepts of multidisciplinary, interdisciplinary, and transdisciplinary, having in mind the cross-cutting dynamics of Curriculum and Knowledge. We will mention authors whose quite relevant studies potentiate an integrated curricular perspective that integrates Training, particularly the Multidimensional Training of Teachers. We will mention some legislation passed as part of the Portuguese Educational System, which helps understand the efforts to introduce interdisciplinary practices in the curriculum at the various levels of education in line with European and even global conceptions. We will highlight, among other possibilities, various areas of knowledge and specialties that substantially contribute – or could contribute – towards interdisciplinary reflection and work, particularly Philosophy of Education and Philosophy of Curriculum

Mergers & acquisitions : Portucel and Suzano Papel e Celulose

The pulp and paper industry is, nowadays, facing challenges associated with the lack of demand growth, pushing firms to adapt to intense competition and industry-wide overcapacity. In order to remain profitable and achieve sustainable competitive positions, industry players have relied on M&A to achieve scale and expand into growing markets in emerging countries. The industry concentration conducted through mergers has been able to deliver value to shareholders while changing the overall competitive landscape. This dissertation’s goal is to propose a merger between Suzano Papel e Celulose and Portucel. The proposition is supported by a review of the main literature on M&A, a thorough industry and company analysis, and a valuation of each individual firm and its combination. It is concluded that Suzano should acquire Portucel in an all-stock offer, valuing the Portuguese firm at €4.32, a premium of 55% over its 31 December 2013 market capitalization. Through the proposed takeover offer, Portucel would be entitled to 46% of the merged firm, with the remaining 54% allocated to Suzano’s shareholders

Vida após o fogo: a resposta da comunidade de artrópodes ao fogo em diferentes tipos de floresta

The response of the arthropod communities to fire in different types of for-est habitats was studied. Ground dwelling arthropods were collected with pitfall traps while aerial arthropods were collected with pan traps set at ground level and in ele-vated platforms in three different forest types, old oak forest, young oak forest and planted eucalyptus forest. Arthropod communities, with emphasis on carabid beetles, were com-pared in terms of abundance and diversity. The collection was carried im-mediately after the fire occurrence and in other two occasions over one-year period. The overall arthropod community showed a diversity increase in the ma-jority of the sampling plots from October 2017 to December 2018 and March 2018, with the eucalypt forest supporting lower diversity. Carabids did show a similar tendency but had a high diversity in eucalypt forest in the sampling immediately after the fire occurrence. Edaphic parameters seem to determine the response of different types of arthropods to fire, with soil water content being the major factor influencing carabid diversity in the eucalypt forest. The results of this work emphasize the importance of choosing an ade-quate bio indicator species as the results obtained with one taxon may not be representative of the overall community.A resposta das comunidades de artrópodes ao fogo em diferentes tipos de habitats florestais foi estudada. Os artrópodes do solo foram coletados com armadilhas pitfall, enquanto os artrópodes aéreos foram coletados com armadilhas cromotrópicas montadas no nível do solo e em plataformas elevadas em três tipos dife-rentes de floresta, floresta de carvalhos velhos, floresta de carvalhos jo-vens e floresta de eucalipto plantada. As comunidades de artrópodes, com ênfase nos besouros carabídeos, foram comparadas em termos de abundância e diversidade. A coleta foi realizada imediatamente após a ocorrência do incêndio e em outras duas ocasiões durante o período de um ano. A comunidade geral de artrópodes mostrou um aumento de diversidade na maioria das parcelas de amostragem de outubro de 2017, dezembro de 2018 e março de 2018, com a floresta de eucalipto a suportar menor diversidade. Os carabídeos mostraram uma tendência semelhante, mas apresentaram uma diversidade elevada na floresta de eucalipto incluindo na amostragem imediatamente após a ocorrência do incêndio. Parâme-tros edáficos parecem determinar a resposta de diferentes tipos de artró-podes ao fogo, com o teor de água no solo a ser o principal fator que influencia a diversidade de carabídeos na floresta de eucalipto. Os resultados deste trabalho enfatizam a importância da seleção criteri-osa e adequada das espécies de bioindicadores, pois os resultados ob-tidos com um táxon podem não ser representativos da comunidade em geral.Mestrado em Ecologia Aplicad